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国标脂肪酶活力测定方法

脂肪酶活力测定方法摘自中华人民共和国轻工行业标准GB/T 23535-2009

脂肪酶活力测定的原理

脂肪酶隶属于羧基酯水解酶类,在一定的温度、PH值范围内,能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸,所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定,用PH计或酚肽指示液指示反应终点,根据消耗的碘量计算其酶活力(反应式为RCOOH+NaOH →RCOONa+H2O)

酶活定义

在40℃温度和pH7.5条件下,1g固体酶粉或1mL液体酶,1min水解底物产生1umol的可滴定的脂肪酸,即为1个 酶活力单位,以u/g(u/ml)表示。

脂肪酶制剂的酶活力,按以下公式计算:

X1  = (V1-V2 )*c*50*n1/0.05*1/15

式中:

X1-----样品的酶活力,u/g

V1----滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(ml);

V2----滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(ml)

c----氢氧化钠标准溶液浓度,单位为摩尔每升(mol/L);

50---0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00ml相当于脂肪酸50umol;

n1----样品的稀释倍数;

0.05----氢氧化钠标准溶液浓度换算系数;

1/15----反应时间15min,以1min计。

所得结果表示至整数。

脂肪酶活力测定

溶液和试剂

1、聚乙烯醇(PVA):聚合度1750±50;

2、橄榄油:试验试剂;

3、95%(体积分数)乙醇;

4、底物溶液:称取聚乙烯醇(PVA)40g(精确至0.1g),加水800ml,在沸水浴中加热,搅拌,直至全部溶解,冷却后定容至1000ml用干净的双层纱布过滤,取滤液备用;取上述滤液150ml,加橄榄油50ml,用高速匀浆机处理6min(分两次处理,间隔5min,每次处理3min),即得乳白色PVA乳化液。该溶液现用现配。

5、磷酸缓冲溶液(PH=7.5):分别称取磷酸二氢钠1.96g和十二水磷酸氢二钠39.62g,用水溶解并定容到500ml。如需要,调节溶液的PH到7.5±0.05;

6、氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.05mol/l]:按QB/T 601配置与标定。使用时,准确稀释10倍;

7、酚酞指示液(10g/l);按QB/T603 配制。


操作方法

一、电位滴定法

1、按PH计使用说明书进行仪器校正;

2、取两个100ml烧杯,于空白杯(A)和样品杯(B)中各加入底物溶液4.00ml和磷酸缓冲液5.00ml,再于A杯中加入95%乙醇15.00ml,与40℃±0.2℃水浴中预热5min,然后于A、B杯中各加待测酶液1.00ml,立即混匀计时,准确反应15min后,于B杯中立即补加95%乙醇15.00ml终止反应取出;

3、在烧杯中加入一枚转子,置于电磁搅拌器上,边搅拌,边用氢氧化钠标准溶液滴定,直至PH10.3为滴定终点,记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

二、指示剂滴定法

1、取两个100ml三角瓶,分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加入底物溶液4.00ml和磷酸缓冲液5.00ml,再于A瓶中加入95%乙醇15.00ml,于40℃±0.2℃水浴中预热5min,然后于A、B瓶中各加待测酶液1.00ml,立即混匀计时,于40℃±0.2℃水浴中准确反应15min,于B瓶中立即补加95%乙醇15.0ml终止反应,取出;

2、于空白和样品溶液中各加酚肽指示液2滴,用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定,直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点,记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。

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